Obecnie z dojajowym podawaniem szczepionek, mamy do czynienia również w szczepieniach przeciwko chorobom Gumboro, Newcastle i ILT. Ta relatywnie nowa technika coraz bardziej zyskuje na znaczeniu i zaczyna być stosowana na coraz większą skalę. Istotną jej zaletą jest również niski nakład pracy ludzkiej, pozwalający na optymalizację kosztów zatrudnienia. Szereg badań przeprowadzonych w ostatnich latach pokazuje, że metoda ta znajduje coraz szersze zastosowanie przy antybiotykoterapii czy suplementacji pożyteczną mikroflorą bakteryjną wpływających korzystnie na integralność przewodu pokarmowego w pierwszych dniach życia, co w efekcie poprawia końcowy wynik produkcyjny.

Sposoby iniekcji in ovo 

Podstawowy sposób iniekcji in ovo  , pozwalający na przemysłowe zastosowanie metody polega na wykorzystaniu w pełni zautomatyzowanej maszyny. Aktualnie na świecie jest czterech wiodących producentów takich urządzeń (Embrex, Viscon-Vinovo i Ecat), których jakość, zasada działania i mechanizm są porównywalne. W pierwszej fazie jajo jest automatycznie lokalizowane, odpowiednio ustawiane i dezynfekowane, a automat wybiera miejsce iniekcji. Następnie skorupa jest nakłuwana pierwszą, zewnętrzną igłą, zaś igła wewnętrzna deponuje substancję na odpowiednią głębokość do wnętrza jaja. Na koniec otwór po iniekcji jest zasklepiany chemicznie, a igły są ponownie dezynfekowane.

Istotnym elementem mającym wpływ na jakość in ovo   jest odpowiednia selekcja jaj, tak aby były one, mniej więcej, jednakowej wielkości. Wiąże się to z odpowiednim zaprogramowaniem głębokości iniekcji i zastosowaniem odpowiednich igieł. Igły zbyt krótkie nie deponują substancji w odpowiednim miejscu, zaś igły zbyt długie mogą powodować uszkodzenie zarodków. Najbardziej uniwersalne igły o długości ok. 13mm pozwalają na skuteczną iniekcję substancji wystarczająco blisko embrionu, jednocześnie powodując relatywnie najmniej uszkodzeń.

W nowych, udoskonalonych generacjach aparatów do szczepienia in ovo   zastosowano technologie podwójnego ciśnienia deponowania, które umożliwia indywidualną adaptację głębokości iniekcji do każdego jaja, niezależnie od rozmiaru. System ten precyzyjnie podaje taką samą dawkę substancji, w to samo miejsce i w tym samym czasie. Wszystkie części stykające się ze skorupą, jak również same jaja oraz igły są dezynfekowanie po każdym wstrzyknięciu. Jaja niezapłodnione, zepsute lub zawierające zamarle zarodki są usuwane jeszcze przed szczepieniem.

Miejsce i czas iniekcji in ovo 

Wiek zarodka i miejsce iniekcji mają ze sobą ścisły związek, a ich dobór zależy od oczekiwanych efektów. Jest kilka typowych miejsc, w które można wykonać iniekcję in ovo  . Najczęściej jest to komora powietrzna, owodnia, omocznia, woreczek żółtkowy bądź sam zarodek.

Fot. 1.       Miejsca iniekcji in ovo (Racaniello, 2009)

Ze względu na stosunkowo duże prawdopodobieństwo uszkodzenia zarodka najbardziej powszechną ze względu na przemysłową możliwość zastosowania w wylęgarniach jest doowodniowa iniekcja szczepionek podczas przekładu lężonych jaj z komór lęgowych do aparatów klujnikowych w 17-19 dniu inkubacji.

Szczepionki podawane in ovo 

Szczepienie in ovo   to z jednej strony chyba najbardziej przyszłościowe zagadanienie w dziedzinie bio-manipulacji na zarodku kurzym, a z drugiej strony najbardziej zaawansowane i coraz szerzej stosowane w przemysłowej produkcji drobiarskiej.

Poprzez właściwie dobrany program szczepień profilaktycznych stad rodzicielskich uzyskujemy odporność bierną, determinowaną odpowiednim poziomem przeciwciał matczynych (MDA) przekazywanych potomstwu. Jednakże przeciwciała matczyne (MDA) z jednej strony gwarantujące zabezpieczenie przeciwko wczesnym zakażeniom w pierwszych dniach życia, z drugiej strony hamujące powstawanie pełnej odporności po szczepieniu. U pisklęcia macierzyste komórki wytwarzające przeciwciała limfocytów B (ang. Prebursal Stem Cells), powstają między 8 a 14 dniem embriogenezy w pęcherzyku żółtkowym, szpiku kostnym i tkance wątrobowej, a następnie migrują do Torby Fabrycjusza, gdzie podlegają różnicowaniu i klonowaniu. Proces ten rozpoczyna się około 12 dnia rozwoju embrionalnego i trwa przez kilka następnych tygodni, maksymalne przyspieszenie osiągając w okresie tuż przed wylęgiem do około 2 dni po wykluciu. Między 18 dniem embriogenezy a 2-4 tygodniem życia większość limfocytów B migruje z Torby Fabrycjusza do grasicy i wtórnych narządów limfatycznych, dzięki czemu już 2-4-tygodniowe kurczęta rozwijają bardzo wszechstronną odporność.

Dlatego niezależnie od tego, czy szczepienie wykonane jest in ovo   około 18 dnia embriogenezy czy tuż po wykluciu, to pozwala na wykształcenie podstawowego mechanizmu odporności przeciwzakaźnej jeszcze przed przedostaniem się przeciwciał MDA do krwiobiegu pisklęcia. Torba Fabrycjusza po spełnieniu swoich funkcji związanych z proliferacją i różnicowaniem limfocytów B zaczyna zanikać między 7 a 13 tygodniem życia kurcząt.

W związku z tym, w przemysłowej produkcji drobiu pojawił się trend do opracowania metody skutecznej immunizacji młodych ptaków, która pozwoli na wczesne wytworzenie czynnej odporności. Na początku lat 80-tych XX wieku niektórzy badacze w USA zwrócili uwagę na możliwość wytworzenia odporności czynnej przeciwko Chorobie Mareka już przez 17-19 dniowe embriony kurze. Po kilku latach badań skonstruowano i opatentowano pierwszą przemysłową maszynę do szczepienia in ovo  . Początkowo była ona stosowana do profilaktyki jedynie Choroby Mareka, ale wkrótce zaobserwowano, że metoda ta z powodzeniem może służyć do zabezpieczenia przeciwko innym chorobom wirusowym, a nawet kokcydiozie. Od samej konstrukcji szczepionki i szybkości uwalniania zawartego w niej antygenu zależy czas pojawienia się odporności czynnej przeciwko różnym chorobom zakaźnym, jak Choroba Mareka, Newcastle, Gumboro, ospa czy ILT.

Szczepienie in ovo przeciwko Chorobie Gumboro

Jednym z najczęściej wykonywanych techniką in ovo   zabiegów profilaktycznych jest szczepienie przeciwko Zakaźnemu Zapaleniu Torby Fabrycjusza (Ch. Gumboro). Przeprowadza się go w 18 dniu inkubacji poprzez iniekcję szczepionki bezpośrednio do worka omoczniowego zarodka. Aktualnie wiele firm szczepionkowych posiada w swojej ofercie różnej generacji szczepionki pozwalające na uzyskanie stosunkowo wczesnej odporności czynnej. Najczęściej stosowane in ovo   szczepionki przeciwko Ch. Gumboro to:

• Szczepionki wektorowe – złożone są one z wektora – wirusa HVT (serotyp 3 wirusa Choroby Mareka), do którego wbudowany jest ważny dla odpowiedzi immunologicznej gen białka VP2 wirusa choroby Gumboro. Z uwagi na fakt, że szczepionki te nie zawierają pełnego wirusa, nie zachodzi tu proces kolonizacji Torby Fabrycjusza, przez co wirus szczepionkowy nie sieje się do środowiska kurnika i nie pasażuje przez zaszczepione ptaki. Zatem ptaki pominięte przy iniekcji nie mają możliwości „doszczepienia się” drogą pokarmową od reszty stada i pozostają wrażliwe na zakażenie do końca życia. Ponadto w przypadku szczepionek wektorowych opartych na wirusie HVT jako nośniku odpowiedź immunologiczna choć dobra i długotrwała, to pojawia się stosunkowo późno i narasta powoli, co wynika z samej właściwości wektora. W praktyce więc pełną odporność przeciwko Chorobie Gumboro brojlery uzyskują około 5-6 tygodnia życia, a więc w zasadzie dopiero w wieku ubojowym.
• Szczepionki immunokompleksowe – produkowane na bazie żywych, atenuowanych wirulentnych szczepów wirusa IBD, które już na etapie produkcji są opłaszczone wyhodowanymi w laboratorium specyficznymi przeciwciałami. Wirus jest uwalniany z tego kompleksu immunologicznego wraz z postępującym naturalnie spadkiem poziomu przeciwciał matczynych (MDA) u piskląt. Uwolniony z wirus szczepionkowy podobnie do konwencjonalnych atenuowanych replikuje w Torbie Fabrycjusza i sieje się do środowiska kurnika. Jest to istotne, gdyż nawet pominięte przy iniekcji pisklęta mają możliwość „doszczepienia się” drogą pokarmową od reszty stada i będą w stanie wykształcić odporność.
• Iniekcyjne żywe szczepionki atenuowane – to innowacyjne rozwiązanie, zapewniające jeszcze bardziej skuteczną ochronę przeciwko chorobie Gumboro. Ta nowatorska koncepcja oparta jest na szczepionce zawierającej odpowiednio zmodyfikowany, żywy i atenuowany wirus Zakaźnego Zapalenia Torby Fabrycjusza. Odpowiednio zmodyfikowany szczep pośredni MB wirusa warunkuje stabilność i bezpieczeństwo szczepionki i podobnie jak konwencjonalne, atenuowane wirusy szczepionkowe replikuje się w Torbie Fabrycjusza. Zasiedlenie Torby Fabrycjusza przez wirus szczepionkowy w odpowiednim momencie jest bardzo istotne, gdyż stanowi skuteczną blokadę przed replikacją wirusów terenowych, w tym szczepów wysoce zjadliwych tzw. very virulent IBDV. Wirus szczepionkowy MB po dostaniu się do organizmu adaptuje się do aktualnego statusu immunologicznego każdego ptaka indywidualnie, replikując w Torbie Fabrycjusza w optymalnym czasie, skorelowanym z postępującym spadkiem przeciwciał matczynych (MDA). Nie mamy więc w tym przypadku do czynienia z „okienkiem immunologicznym”, gdyż spadkowi poziomu MDA (początkowo wiążących wirusy szczepionkowe) towarzyszy równoległy wzrost poziomu własnych przeciwciał swoistych, stymulowanych przez wirus szczepionkowy replikujący w Torbie Fabrycjusza. Na podstawie wielu terenowych doświadczeń udowodniono, że szczepionki oparte na pełnym, atenuowanym wirusie indukują skuteczną odporność średnio o 4 dni wcześniej niż szczepionki immunokompleksowe.Należy nadmienić, iż replikujący w Torbie Fabrycjusza wirus szczepionkowy podobnie jak w przypadku klasycznych szczepionek atenuowanych oraz immunokompleksowych atenuowanych sieje się do środowiska kurnika, a pominięte przy iniekcji pisklęta mają możliwość „doszczepienia się” i wykształcenie dobrej odporności.

Zalety i wady metody szczepienia in ovo 

Podstawową zaletą metody in ovo   jest możliwość jej masowego zastosowania, przez co znacznie obniża się koszt szczepienia. W krótkim czasie jednocześnie można zaszczepić dużą ilość piskląt, a automatyzacja całego procesu eliminuje błędy obsługi, ogranicza nakład ręcznej pracy i wykonuje automatyczną selekcję jaj nadających się do dalszej inkubacji. Dezynfekcja na każdym etapie procesu pozwala uzyskać lepszej jakości materiał do dalszej hodowli i minimalizuje ryzyko zakażeń wtórnych. Zaszczepienie wyłącznie prawidłowo rozwiniętych embrionów pozwala na wcześniejsze przygotowanie organizmu pisklęcia do wykształcania mechanizmów odporności swoistej oraz uzyskanie lepiej wyrównanych pod względem immunologicznym stad. Dzięki temu jesteśmy w stanie skutecznie ograniczać skutki wczesnych zakażeń wirusami Choroby Mareka czy Gumboro.

Jakość jednodniowych piskląt ma ogromny wpływ na końcowy wynik tuczu. Zdrowe, odpowiednio zaszczepione i w pełni rozwinięte pisklęta charakteryzują się lepszymi przyrostami oraz przeżywalnością. W rezultacie wprowadzenia metody in ovo   eliminujemy także stres pisklęcia związany z iniekcyjnym szczepieniem w pierwszym dniu życia, a także skracamy czas dostawy piskląt z wylęgarni do fermy.

Metoda in ovo   w porównaniu to tradycyjnych szczepień w pierwszym dniu życia wcześniej pobudza układ odpornościowy. Wyniki niektórych badań wykazały obecność pierwszych przeciwciał przeciwko Chorobie Mareka już u 3-dniowych piskląt, natomiast u ptaków szczepionych w pierwszym dniu życia przeciwciała zaczynały się pojawiać w 7 dobie życia. Zastosowanie in ovo   szczepionki przeciwko Chorobie Gumboro w zasadzie zabezpiecza stado do końca trwania cyklu produkcyjnego. Nie ma zatem potrzeby doszczepienia kurcząt na fermie, przez co oszczędzamy czas, pracę i unikamy problemów związanych z nieprawidłowym zaszczepieniem w kurniku.

Niestety metoda iniekcji in ovo   posiada także swoje niedoskonałości, z których podstawową jest wysoki koszt utrzymania sprzętu, zwłaszcza konieczność zapewnienia wysoko wyspecjalizowanego serwisu, odpowiednich, markowych środków do pielęgnacji i dezynfekcji urządzenia oraz konieczność podniesienia standardów bioasekuracji i higieny w wylęgarni.

Urządzenia in ovo   potrafią osiągnąć wydajność szczepienia do osiąga 60 000 jaj na godzinę, dlatego biorąc pod uwagę potrzebę maksymalizacji wydajności urządzenia, logistykę oraz niemałe gabaryty samych urządzeń jedynie duże zakłady wylęgowe są w stanie pozwolić sobie na utrzymanie urządzeń do szczepień in ovo  .

Pomimo tych wszystkich niedogodności metoda in ovo   zyskuje coraz więcej zwolenników, zaczyna być coraz częściej stosowana, a firmy farmaceutyczne, zwłaszcza te produkujące szczepionki, coraz większą uwagę zwracają na rozwój preparatów, które mogą być podawane w iniekcji dojajowej.

Spis literatury dostępny u autora: wojciech.hodorowicz@pahc.com

Artykuł opublikowany w wydaniu XII 2020 „Polskie Drobiarstwo”.

References:

• Avakian A, Wakenell P, Bryan T, Schaeffer J, Williams C, Whitfill C. In ovo administration of Marek’s disease vaccine: Importance of vaccine deposition site in the fertile egg, in Proceedings. 51st Western Poultry Disease Conference 2002
• Barbosa T, Williams C, Villalobos T. Efficacy and Marek’s disease protection comparison between different vaccination methods, in Proceedings. 18th Congress World Veterinary Poultry Association 2013
• Bednarczyk M. Technologia in ovo narzędziem w sterowaniu jakością produkcji drobiarskiej. Polskie Drobiarstwo 9/2010
• Bednarczyk M, Brzezińska J, Kasperczyk K, Siwek M, Sławińska A, Urbanowski M. Technologia in ovo narzędziem w nowoczesnej profilaktyce drobiu. Biotechnologia 1/2010
• Borzemska W, Szeleszczuk P. Szczepienie in ovo – nowa technika immunizacji drobiu. Medycyna Weterynaryjna 55(1) /1999
• Czyszczon W, Krakowiak D, Dados E, Batkowska J. Iniekcja in ovo jako forma biomanipulacji na zarodku ptasim. Wiadomości Drobiarskie 4/2018, 5/2018
• Hopkins B, Williams C. Field evaluation of the accuracy of vaccine deposition be two different commercially available in ovo injection systems. Poultry Science 90/2011
• Pijarska-Binkowska I. Technika szczepień in ovo w profilaktyce drobiu. Magazyn Weterynaryjny, Dodatek 2010.
• Racaniello V. Influenza virus growth in eggs. 2009. www.virology.ws/2009/12/10/influenza-virus-growth-in-eggs/
• Urbanowski M. Szczepienia drobiu podawane droga in ovo . Weterynaria w terenie 1/2010
• Williams C. In ovo vaccination and chick quality. International Hatchery Practice 19(2)/2005
• Williams C. In ovo vaccination for disease prevention. International Poultry Production 15(8)/2007
• Williams C, Zedek A. Comparative field evaluations of in ovo applied technology. Poultry Science 89/2010 :1